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胚胎基因编辑应用解析

信息来源:www.sddysc.cn  |   发布时间:2021年09月27日

基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来,就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势,技术不断改进后,更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

应用方向

1)基因敲除:如果想使某个基因的功能丧失,可以在这个基因上产生DSB,非同源末端连接(NHEJ)修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除(indel),造成移码突变,从而实现基因敲除。

2)特异突变引入:如果想把某个特异的突变引入到基因组上,需要通过同源重组来实现,这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低,而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率,从而实现特异突变的引入。

3)定点转基因:与特异突变引入的原理一样,在同源模版中间加入一个转基因,这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中,从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点,这个位点是一个开放位点,支持转基因长期稳定的表达,破坏这个位点对细胞没有不良影响,因此被广泛利用。

面这篇文章就是针对第三个应用方向的成功阐述。 

借助电转方法将Cas9蛋白质/sgRNA导入小鼠原核受精卵生成非嵌合体突变体

摘要

CRISPR/Cas9系统被广泛应用于各种有机体,特别是小鼠,用来阐明基因的作用。为了获得优化的小鼠胚胎,Cas9 mRNA和sgRNA通常通过注射或是电转导入受精卵。然而,由此种方法生成的大多数突变体都是嵌合体,包含不同类型的突变体,导致复杂的表型分析。为了使基因功能分析更加简化,急迫的需要寻找一种生成非嵌合体突变体的方法。这里,我们确定了一种方法,可以生成非嵌合体小鼠突变体胚胎。我们通过电转化同时导入Cas9蛋白质和sgRNA 入离体小鼠受精卵。确保基因编辑发生在小鼠基因组的第一次复制之前。结果,所有细胞都携带相似的突变体表现型。这个方法解决了利用CRISPR/Cas9系统产生的嵌合体突变体的问题。

材料与方法

电转化

CUY21EDIT II和LF501PT1-10铂金盘电极(长:10mm,宽:3mm,高:0.5mm,gap:1mm)(BEX Co. Ltd., Tokyo, Japan)用于电转化。

电极连接在电转化仪上,另一端连接在体式显微镜下。30-40个来自于交配受孕或体外受孕的受精卵同时进行电转染。受精卵培养在KSOM培养基内,用Opti-MEM I 清洗三遍,去掉血清,在电极的槽内纵向排列成一条直线,并添加5uLOpti-MEM I,并加入Cas9蛋白质和sgRNA或mcherry mRNA。电转条件是30V (3ms 脉冲时长+97ms间隔)7个cycle。电转后,受精卵立即从电击槽中取出,分别用M2培养基洗4次、KSOM培养基洗2次。随后受精卵培养在37℃,5%CO2培养箱内,直至出现二细胞阶段。


结果

图 通过电转化Cas9蛋白质和sgRNA生成Fgf10突变体胚胎。(a)Fgf10基因和sgRNA靶序列。(b)电转化发生的时间。电转发生在体外受孕后5h。交配受孕受精卵电转发生在E0.5。(c)代表胚胎展示了不同的肢体表现型:T1(没四肢)T2(肢体缺陷,无前肢或无后肢)。Control受到电击,但是没有转入Cas9蛋白和RNA。

总结

我们阐述了这种方法,将Cas9蛋白质和sgRNA转入体外受精的卵细胞中,生成突变体。在DNA第一次复制前,通过NHEJ-介导的缺失插入或是HDR-介导的基因插入,生成嵌合度较低的突变小鼠。我们的电转方法对构建转基因模式小鼠非常有效。



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