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超微量分光光度计 | 超微量与物种鉴定——蓝藻,哪里逃

信息来源:www.sddysc.cn  |   发布时间:2021年12月29日
引言


蓝绿藻,也称为蓝藻,它们能迅速形成藻华,而造成巨大的环境问题。藻类大量繁殖会耗尽氧气供应并降低湖泊和海洋中的光照水平,从而杀死鱼类和其他水生生物。此外,蓝藻会产生有害毒素,例如肝毒素等,对动物和人类产生毒害作用。


蓝藻已经进化了数十亿年,可以在包括极端高温、pH值和盐碱环境在内的各种气候中生存和繁衍,表明这些有害的藻华 (HAB) 会在全球范围内造成环境问题。蓝藻毒素的性质和物种之间的丰度差异很大,因此快速、灵敏地鉴定这些物种的方法必不可少。事实上,有毒物种的早期检测对于确保在这些 HAB 污染水源之前加以预防至关重要。Denovix超微量除了测量核酸方面表现优秀,在物种鉴定方面也竭诚发光发热!


aspreet K Sound等科研工作者首次展示利用原生质谱(Native Mass Spectrometry)快速准确地识别来自不同水生环境的蓝藻,该研究成果最终发表在杂志“Analytical Chemistry”上,题目为“Rapid Cyanobacteria Species Identification with High Sensitivity Using Native Mass Spectrometry” ,IF=6.982 [1] .

#摘要

快速鉴定蓝藻对于监测和预防有毒藻类大量繁殖至关重要。在这里,我们首次展示了原生质谱如何快速准确地识别来自不同水生环境的蓝藻。通过监测藻胆蛋白(蓝藻内丰富的蛋白质复合物),创建了每个物种独有的简单易懂的质谱“指纹”。而且,我们的方法比当前的 MALDI-TOF质谱方法灵敏10倍,这意味着可以在水华形成之前使用该技术监测蓝藻。总之,这些数据非常有望同时检测和识别共存蓝藻。

#简介
01光学显微镜

传统上,蓝藻鉴定依靠光学显微镜来区分物种并根据其形态对它们进行分类。然而,由于它们的高度生物多样性,许多蓝藻具有非常相似的形态,因此使用显微镜技术无法区分它们,特别是在具有相似形态的多个物种共存的情况下。

02分类鉴定

分类鉴定对16S rRNA基因和DNA内部转录间隔区进行额外的分子分析。但蓝藻与其他微生物相关联,获得无菌蓝藻培养物是一个困难且耗时的过程,并且在蓝藻和微生物之间的共生关系很强的情况下几乎是不可能的。

03宏基因组学

宏基因组学能够从微生物群落中对个体基因组进行测序。然而,分析宏基因组数据需要专业知识,因此并未广泛开展。此外,在某些情况下,仅 16S rRNA 无法区分形态不同的物种。

04基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱

基因组测序的另一种方法是从蓝藻独特的功能蛋白质成分中识别蓝藻。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF MS) 在该领域大获关注,在临床环境中也经常用于识别各种细菌、真菌、和原生动物。它快速且易于使用,但很少用于识别蓝藻。

遗憾的是,由于使用完整细胞 MALDI-TOF MS 识别的蛋白质和光谱特征的数量,解释数据可能很复杂,需要专业知识来确定光谱差异是否与存在的不同物种或藻类物种内不同的蛋白质丰度相关展示。此外,蓝藻中的大多数蛋白质的质量在 2-20 kDa 范围内,这使得光谱重叠很常见。以及,许多已鉴定的蛋白质在物种之间具有相同的蛋白质序列,因此无法通过该法区分它们。

#原生MS应运而生

质谱作为一种技术的速度、精度和可用性仍然可以利用,只是需要更简单的质谱方法。在该文章中,Jaspreet K Sound等科研工作者开发了一种简单的Native Mass Spectrometry原生质谱 (MS) 方法,该法结合了 MALDI-TOF MS 技术在速度和易用性方面的优势。原生MS依赖于将蛋白质和蛋白质复合物保存在气相中,使它们能够在其生物学功能状态下被检测到。因此,原生MS可用于简化质谱,因为当多种蛋白质组合在一起形成蛋白质复合物时,它们的质量几乎总是独一的,因此光谱重叠最小。此外,使用最近开发的高分辨率仪器,只需要在整个蛋白质复合物的一个蛋白质亚基中进行小的氨基酸取代,就可以区分不同的蛋白质复合物,从而区分一个物种与另一个物种。


蓝藻中丰富的核心光合成分,称为藻胆体。蓝藻细胞中多达50%的可溶性蛋白质构成藻胆蛋白--本身就是藻胆体内的蛋白质复合物。藻胆蛋白很容易进行原生MS分析,蓝藻基因组中几乎所有的藻胆蛋白亚基氨基酸序列都是不同的,这意味着理论上可以使用任何电喷雾电离MS方法轻松区分它们的蛋白质质量。当使用原生MS查看蛋白质复合物水平时,所有物种都会产生独特的质谱。


在文章中,作者表明原生 MS 确实可以独一地识别蓝藻物种。通过对蓝藻细胞裂解物的原生MS 分析,可观察到与蓝藻内独特的藻胆蛋白复合物相对应的简单质谱“指纹”。由于 Orbitrap 质量分析器提供的高分辨率,检测到的每个物种都彼此基线分离,没有检测到光谱重叠,这意味着可以从非无菌培养物中识别每个蓝藻物种。最后,作者比较了原生 MS 方法对蓝藻检测的灵敏度。数据显示,体积相对较小(~50 mL)的蓝藻可以在藻华形成之前以相当于荧光光谱技术的水平被识别,同时使用比现有 MALDI-TOF MS 方法少10倍的样本。总体而言,数据显示原生 MS 在快速鉴定蓝藻物种方面具有非凡潜力。

01物种鉴定实验

作者使用DS-11 分光光度计 (DeNovix),以 1(mg/ml)-1cm-1的消光系数测量来自大螺旋藻、圆球藻、Gloeocapsopsis crepidinum、Nodularia harveyana、Spirulina subsalsa和Oscillatoria nigroviridis的提取物的总蛋白质浓度,最终将提取物以等比例混合使得蛋白混合液最终浓度约为 0.065 mg/mL,随即通过天然 MS 进行分析。


02别藻蓝蛋白检测限实验

作者使用DS-11 分光光度计 (DeNovix) 进行测量,并假设消光系数为 700,000 M-1cm-1,别藻蓝蛋白的浓度由其在652 nm处的吸光度确定。从0.72 g/L 的储备溶液中,将别藻蓝蛋白稀释到10 mM 醋酸铵中,使其浓度分别为 50、10、5、2.5和1.26 mg/L,然后通过天然 MS 分析样品。50和5 mg/L 别藻蓝蛋白溶液还通过紫外-可见光谱在 220-750 nm 范围内进行监测,以 1 nm 的规则间隔读取读数。



03原生MS物种鉴定的检测限实验

作者使用DS-11 分光光度计(DeNovix)和Bennett和 Bogorad (1973) 中定义的方程,分别通过测量620和650 nm处的吸光度来确定裂解物的别藻蓝蛋白和藻蓝蛋白浓度。

图片DeNovix
超微量分光光度计超微量模式下,DS-11的蛋白检测范围0.04-1125mg/ml BSA;荧光模式下,蛋白检测范围是12.5ug/ml-1125mg/ml。DS-11仅为DS-11系列中的一款型号,不同型号拥有不同配置,不同检测模式满足不同检测限要求,适用于超广研究方向和使用者群体。感谢Jaspreet K Sound等科研工作者给予DS-11 分光光度计点亮蓝藻独特质谱“指纹”的机会,希望Denovix品牌的超微量DS-11系列产品能够参与点亮更多科研领域新发现,超微量之力,虽听起来绵薄,但我们竭诚贡献!


DS-11系列主要特点

 # 主机超微量模式始终如一的精度、终身免校。专利的SmartPath和Brigde testing技术保驾护航。

 # 无论是微量模式还是紫外荧光一体式:测量样品的浓度范围很宽,上下限均是行业内的翘首。

 # 根据样品浓度不同,自动变换测量光程。受专利保护(US9442009B2)。超微量模式:0.02mm自动变换至0.5mm

 # 污染物分析功能SmartQC,污染物种类鉴定报告,提示污染物,结合荧光模块检测。

 # 微量模式下,蛋白质浓度无限制准确测量。无需稀释至比色皿,微量即可检测高浓度的蛋白质。  

 # 一款整合了荧光光度计的超微量,拓展了用户类型。

[1] Sound JK, Peters A, Bellamy-Carter J, Rad-Menéndez C, MacKechnie K, Green DH, Leney AC. Rapid Cyanobacteria Species Identification with High Sensitivity Using Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2021 Oct 26;93(42):14293-14299. doi: 10.1021/acs.analchem.1c03412. Epub 2021 Oct 17. PMID: 34657414; PMCID: PMC8552214.


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